试述酶活力测定的基本步骤
正确答案:酶活力测定通常包括两个阶段。首先在一定条件下,酶与底物反应一段时间,然后再测定反应液中底物或产物的变化量。一般经过如下几个步骤:
(1)根据酶催化的专一性,选择适宜的底物,并配制成一定浓度的底物溶液。所使用的底物必须均匀一致,达到酶催化反应所要求的纯度。在测定酶活力时,所使用的底物溶液一般要求新鲜配制,有些反应所需的底物溶液也可预先配制后置于冰箱保存备用。
(2)根据酶的动力学性质,确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。温度可以选择在室温(25℃)、体温(37℃)、酶反应最适温度或其他选用的温度;pH应是酶催化反应的最适pH;底物浓度应大于5Km等。反应条件一旦确定,在整个反应过程中应尽量保持恒定不变。故此,反应应该在恒温槽中进行,pH的保持恒定是采用一定浓度和一定的pH缓冲溶液。有些酶催化反应,要求一定浓度的激活剂等条件,应适量添加。
(3)在一定的条件下,将一定量的酶液和底物溶液混合均匀,适时记下反应开始的时间。
(4)反应到一定的时间,取出适量的反应液,运用各种生化检测技术,测定产物的生成量或底物的减少量
(1)根据酶催化的专一性,选择适宜的底物,并配制成一定浓度的底物溶液。所使用的底物必须均匀一致,达到酶催化反应所要求的纯度。在测定酶活力时,所使用的底物溶液一般要求新鲜配制,有些反应所需的底物溶液也可预先配制后置于冰箱保存备用。
(2)根据酶的动力学性质,确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。温度可以选择在室温(25℃)、体温(37℃)、酶反应最适温度或其他选用的温度;pH应是酶催化反应的最适pH;底物浓度应大于5Km等。反应条件一旦确定,在整个反应过程中应尽量保持恒定不变。故此,反应应该在恒温槽中进行,pH的保持恒定是采用一定浓度和一定的pH缓冲溶液。有些酶催化反应,要求一定浓度的激活剂等条件,应适量添加。
(3)在一定的条件下,将一定量的酶液和底物溶液混合均匀,适时记下反应开始的时间。
(4)反应到一定的时间,取出适量的反应液,运用各种生化检测技术,测定产物的生成量或底物的减少量
答案解析:有
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