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军队文职招聘考试

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DNA重组是酶在生物技术上的成功应用,请简述DNA重组的步骤?

正确答案:1.目的基因的获得
方法有:基因文库(cDNA文库、基因组文库)、PCR(放达效应)、人工合成
2.目的基因与载体连接
方法有:——粘性末端——全同源性、定向克隆(两种酶切)
定向克隆可防止高背景的产生,因为全同源性会造成载体自连、重组子、目的基因自连三种可能,重组子可能还会出现正反插入的情况,使筛选过程复杂。
——平末端
酶切后也有可能产生平末端,也会出现高背景。
——人工接头——连接子(连入带粘性酶切位点的片断,再酶切)、普适子(一条链连上片断,成为粘性末端)、T-A克隆(PCR中使用的Taq聚合酶会根据模板延伸至后在链末尾加上一个A,可在克隆载体上加上T,使之连接)、同聚物加尾(末端转移酶加尾)
由于平末端连接效率比较低,可在其两端人工修饰
反应体系:目的基因、载体、T4连接酶、缓冲液
3.重组DNA导入受体(宿主)细胞——转化、转染、转导、感染
主要运用的是原核转化(导入感受态细菌,感受态:处于易于吸收外缘DNA的状态,方法:氯化钙法:DNA与其形成羟基-磷酸钙复合物,抗DNase水解)、真核转染。
4.选与鉴定
方法:
——遗传学(表形)——插入失活、蓝-白筛选、抗性基因(四环素Tet、氨苄青霉素Amp)
——酶切,在电泳(分子量、构想)
——PCR(特异性引物)
——核酸杂交(southernblot)
——免疫学方法(westernblot)
——DNA测序(sanger、焦磷酸测序)
答案解析:
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